Totally Spies! conte les aventures de trois étudiantes de Malibu qui suite à un incident sont devenues espionnes pour le WOOHP (World Organization Of Human Protection) alors qu'elles n'étaient que lycéennes. Tout en continuant à gérer leur vie quotidienne, elles doivent remplir des missions sous les ordres de Jerry, un quinquagénaire qui a fondé le WOOHP et le dirige. Les Totally Spies! disposent d'un grand nombre de gadgets pour chaque mission, gadgets qui allient l'utile à l'agréable.
L'équipe des Totally Spies! est constituée de trois étudiantes : Sam (la rousse), Alex (la brune) et Clover (la blonde). Elles étudient dans la prestigieuse Malibu University (Mali-U). Les 3 étudiantes sont toujours à la pointe de la mode et leurs qualités en font des filles très populaires. Mais Sam, Alex et Clover sont avant tout des espionnes de choc, spécialistes du close combat... gare aux méchants qui se trouvent sur leur route !
Clover est blonde aux yeux bleus. Elle porte la combinaison d'espionne rouge. C'est la plus « fashion » des Totally Spies!, une vraie victime de la mode. Son rêve : faire de la télé ou du cinéma. Pour y arriver elle cherche à rencontrer des stars. Sa quête de célébrité la pousse à toujours vouloir augmenter sa cote de popularité. C'est une bonne actrice, mais elle dégaine aussi vite un gadget qu'une bonne répartie. Clover poursuit également une autre quête... celle des garçons !
Sam est rousse aux yeux verts. Elle porte la combinaison d'espionne verte. C'est l'étudiante modèle. Elle est brillante et à la pointe de la science. Sam est d'un caractère calme et posé. Sa passion : les voyages et la culture. Et les beaux voyageurs cultivés ! Sam, malgré son statut d'intellectuelle, est elle-aussi très « fashion » et très populaire.
Alex est brune aux yeux marrons. Elle porte la combinaison d'espionne jaune. C'est la plus sportive des trois Totally Spies! Dans les missions elle fait preuve d'une grande souplesse et d'un formidable tonus, car c'est une véritable championne d'arts martiaux. Alex est aussi LA copine parfaite. Très sympa et ouverte aux autres, elle est toujours prête à consoler et soutenir ses amies, ou à s'éclater avec elles !
Les Totally Spies! connaissent Mandy depuis longtemps car elles sont allées dans le même lycée puis la même université qu'elle. Mandy ne perd pas une occasion de se moquer de Clover, Sam et Alex, et est devenue leur ennemie numéro 1. Les Totally Spies! la détestent car elle a tous les défauts de la petite fille riche trop gâtée et orgueilleuse. Sa principale rivale est Clover, elles s'affrontent toutes les deux sur le terrain de la mode et bagarrent dur pour devenir la fille la plus populaire. Cette année, à l'université, elle a été rejointe par sa cousine Mindy, son insupportable clone blond. Attention crêpage de chignon à l'horizon !
Le WOOHP est une agence d'espionnage au service de toute l'humanité, et reconnue par tous les gouvernements. Son but est de protéger le monde des criminels les plus dangereux et étranges qui soient.
Jerry est le fondateur et le chef du WOOHP. C'est un gentleman anglais d'une cinquante d'années. Il a bien mérité sa place, car c'est un talentueux créateur de gadgets et un adepte des arts martiaux toujours efficace.
The Groove est LE centre commercial, l'endroit où se trouvent les magasins les plus tendances. Le territoire de chasse préféré des Totally Spies! donc...
Un gadget est toujours le fruit de la combinaison de deux éléments : un outil de haute-technologie à la James Bond, et surtout un look PARFAIT, souvent basé sur un objet utile de panoplie féminine (rouge à lèvres, bottes « fashion », bracelet ou boucle d'oreille, sèche cheveux, lime à ongles...).